| 货号 |
名称 |
规格 |
| HIW0026 |
WB抗体高效反应液 |
100ml
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本产品专门用于Western blot实验中膜的封闭和抗体的稀释，本品含有特殊有机化合物成份，可显著缩短实验反应时间，从而提高实验效率。本产品含有不同分子量范围的惰性蛋白，可有效降低背景，并且保护抗体的活性，使用本产品稀释好的抗体工作液，通常可以在4℃存放3个月以上。本产品含有病理级防腐剂，可以兼容HRP，因此本产品即可以稀释一抗（包括磷酸化一抗），也可以稀释HRP标记的一抗或二抗。本产品还可以稀释荧光标记的一抗和二抗。不适用的情形：本产品含有BSA，不能用于稀释抗BSA一抗。本产品为半透明胶体，如有不溶成团或成块聚集物请勿使用。
| 产品名称 |
WB抗体高效反应液 |
| 产品编号 |
HIW0026 |
| 曾用货号 |
HKW3001 |
| 运输与储存 |
短期内（60天）可放置于2-8℃保存，长期保存可冻存于-20℃或-80℃，避免反复冻融。运输温度2-8℃。建议分装保存，复融后混合均匀再使用。 |
| 使用方法 |
小量细菌的快速裂解，后续可接小量诱导蛋白的可溶性鉴定。
中量细菌的快速裂解，后续可接蛋白纯化、性质表征。
大量细菌的快速裂解，降低样品粘度，有利于提高规模制备的效率以及蛋白纯度。菌体收集
对细菌进行培养，诱导表达目的蛋白。通过离心、超滤等适当方法，去除发酵液上清，收集菌体，对菌体进行称重，记录重量。
菌体裂解
按照1g湿菌体加入9mL Tris-HCl缓冲液（如TBS缓冲液：20mM Tris，150mM NaCl，pH7.6）的比例，对菌体进行重悬，确保分散充分，可采用旋涡震荡、磁力搅拌等手段。缓冲液不推荐磷酸盐（PBS），因其会抑制核酸酶活性，但抑制作用并不明显，如果使用PBS缓冲液，请适当延长裂菌时间。
按照菌体重悬液体积的1/9（V/V，例如：使用了9mL TBS缓冲液重悬，就加1mL裂菌液）加入大肠杆菌裂解液，搅拌或振荡混合均匀。
将样品置于4-25℃条件下（温度根据蛋白稳定性进行合理选择），裂解1-10分钟，会看到菌体悬液渐渐变清亮透明。如果目的蛋白可溶，可以选择快速裂解，约1分钟即可释放80%以上的目的蛋白至上清中；如果目的蛋白是包涵体，可以选择更长裂菌时间，尽量充分消化细胞壁，以便获得纯度更高的包涵体。
使用离心（离心力＞8000g）的方法，分离上清与沉淀。如果目的蛋白为可溶蛋白，取上清进行后续纯化；如果目的蛋白是包涵体，收集沉淀样品，对沉淀中的包涵体进行洗涤、变性溶解，再使用适当方法进行纯化。
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| 注意事项 |
因裂菌液采用了溶菌酶消化细胞壁的策略进行破壁，会释放胞壁二糖成份，竞争结合麦芽糖结合蛋白的底物结合位点，因此本产品与MBP-tag纯化体系不兼容。其它常见的His-tag、GST-tag、TactinII-tag、FC-tag、S-tag、proteinA-tag、
CBD-tag 等技术体系不受影响。
本产品使用了温和的非离子型去垢剂，不会造成蛋白失活，使用的复合溶菌酶以及核酸酶均不带纯化标签，不会干扰下游纯化。
实验室最常用的诱导剂为IPTG，通常使用终浓度为10μM-1mM，诱导剂浓度对于目的蛋白的溶解性影响并不大，不用在摸索诱导剂浓度上浪费时间，我们推荐使用0.1mMIPTG的诱导浓度。若希望改善可溶比例，优先考虑低温以及增加促溶标签。乳糖也可以很好的诱导特定启动子的表达，最终收获的菌量会比IPTG更高。在LB培养基中，37℃诱导，通常4小时目的蛋白表达量即达到高峰，可以收集菌体。如果使用低温诱导，诱导时间可适当延长至6-8小时。过夜诱导对于大部分蛋白的表达并没有明显的收益，菌量增加很少但降解条带增多。
实验室的LB培养基表达，每升可以收获菌体约为3g，如果是发酵罐高密度发酵，每升培养基可以收获菌体100g。收获的菌体暂时不用，需要保存在-20℃或-80℃条件，防止降解。
对于使用LB培养基进行摇瓶培养，可以按照每升收获的菌体加入27mLTBS 缓冲液，低温震荡或者超声清洗槽内超声分散完全后加入3mL 大肠杆菌裂解液，震荡混匀即可看到菌体悬浊液逐渐澄清。
菌体裂解在最优条件下1分钟即可以完成，如果缓冲液不合适，比如含有磷酸盐、含有高盐、pH偏离中性等，裂解速度会变慢。如果赶进度，可以去离心，对可溶目的蛋白的释放影响不大，离心之后，核酸酶与溶菌酶留在上清中，可以继续消化。如果不赶进度，可以适当延长裂菌时间。
室温20-25 ℃条件下，裂菌液含有的酶活力较高，但通常推荐4℃低温裂菌，以控制目的蛋白的降解。
离心之后，通常样品已经得到充分澄清，并不需要再做深层过滤或者膜包过滤；如果样品不够澄清，可以考虑增加其它澄清步骤。
使用简洁，无需再添加额外的核酸酶。但加入裂菌液之前，菌体要分散充分，这样更有利于裂菌。
本产品不含有螯合剂EDTA, 所以不会造成镍离子的脱落，但通常考虑到后续放大的重复性，在使用镍亲和填料体系的时候，推荐使用第三代 NiSmart亲和填料，这一产品高度耐碱清洗，不用每次使用都进行再生。
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