蛋白免疫印迹（Western blot）技术作为分子生物学重要的手段，是一种常规的蛋白分析 技术，常用于鉴定蛋白类型，并能对蛋白进行定性和半定量分析。其基本原理是利用抗原抗体 的特异性反应，通过变性胶 SDS-PAGE 将不同分子量的蛋白质电泳分离，然后转移到固相载 体 （通常为 PVDF 膜或者 NC 膜）上，使用BSA 或者脱脂牛奶将膜进行封闭处理，随后利用一 抗与目的蛋白进行结合，利用二抗与一抗结合，通过级联放大反应后，使用化学发光液以及配 套仪器设备对目的蛋白进行显像，最终通过分析蛋白条带强弱进行表达量分析。由于Western blot 实验操作简单，已经成为实验室必备技能之一。
当我们兴致勃勃的做完Western blot 实验，准备进行结果分析时，我们预期的结果是这 样的：
可实际上，仪器给我们呈现的结果是这样的（勉强还能接受是吧）
这样的（这个是烙饼嘛，看到这个结果就饱了！！！！），
甚至是这样的（你经历过绝望吗？？？？）：
难怪每个刚进入实验室的师妹都很纳闷为什么显影仪前面始终都坐着一名唉声叹气的师兄。为 什么我们每次Western blot之后的条带会是千奇百怪呢？我们如何进行解决呢？本期，小橙 子为大家整理了常见的“丑拒条带 ”原因分析以及一些实验小技巧，一起学习下吧。
丑拒条带第 1 种：个别条带出现弯折变形（小问题）
原因分析：
（1）蛋白凝胶中含有微小气泡或者不溶性颗粒阻碍蛋白分子迁移；
改进方法：
（1）制胶前，充分刷洗玻璃板和梳子，避免凝胶等其他小颗粒残留；
（2）制胶时，充分混匀凝胶液后从胶板一侧缓慢加入凝胶液，每次加入移液枪中90%液体即 可，避免产生气泡；
（3）配制分离胶时，使用无水乙醇进行液面压平，也可除去气泡；
（4）浓缩胶尽量加满胶板，梳子从两侧同时按下，避免产生气泡；
丑拒条带第 2 种：条带上坡或下坡（不要太离谱就能用）
原因分析：
（1）电泳槽漏液（概率最大），导致电流不均一；
（2）蛋白凝胶成分不均匀，影响蛋白泳动（概率不大）；
改进方法：
（1）上样前检查电泳槽是否存在漏液情况；
（2）混匀制胶液；
丑拒条带第 3 种：条带两边浓中间浅，呈哑铃状
原因分析：
（1）制胶液使用前没有混匀，蛋白胶凝固不均匀；
（2）蛋白样本不溶性杂质过多，导致电泳时蛋白被挤压至两侧；
改进方法：
（1）使用前保证制胶液试剂充分溶解，没有沉淀或者杂质；
（2）制胶时充分混匀制胶液后进行制胶；
（3）蛋白样本使用前进行离心处理，吸取上清进行加样；
（4）蛋白凝胶尽量现用现配，制胶用玻璃板和梳子洗干净后风干使用；
丑拒条带第 4 种：条带呈现波浪线（条带也想浪一波）
原因分析：
（1）电泳时电压过高，产热多，或者电泳速度过快，凝胶变形；
（2）转膜过程产热过多，条带扭曲；
（3）凝胶凝固不均一（这也太不均一了，概率不大）；
（4）样品中含有细胞碎片或者 DNA，影响蛋白迁移速率；
（5）转膜时夹的过紧，导致凝胶变形；
改进方法：
（1）调整电泳时的电压（电压真的很重要，说了好多次了）；
（2）转膜时注意低温，加冰袋，加冰袋，加冰袋（重要的事情说三遍）；
（3）配胶时注意混匀，注意温度对凝固速度的影响（看看是不是空调对着你的胶吹风呢）；
（4）提蛋白时注意去除 DNA，上样前离心后用上清上样；
（5）别夹太紧，勒太紧了受不了；
丑拒条带第 5 种：条带在对你皱眉或微笑（估计你是笑不出来）
原因分析：
（1）电泳缓冲液多次使用；
（2）电泳缓冲液配制有问题，试剂过期或者配比出错；
（3）蛋白凝胶配制过久导致干燥；
（4）凝胶凝固不均一或者有不溶性颗粒；
（5）电压过大导致电泳速度过快（微笑）；
改进方法：
（1）使用新鲜的电泳缓冲液（电泳缓冲液使用 2-3 次真的就该换了）；
（2）更换过期试剂，按正确配比配制电泳缓冲液；
（3）蛋白凝胶现用现配，长时间不用可以加点水密封后放到 4℃保存；
（4）注意混匀制胶液，检查是否出现不溶性颗粒；
（5）调整电压，浓缩胶 60-80 V，分离胶 80-120 V（具体自己把握）；
丑拒条带第6 种：背景深（能用就行，要啥自行车）
原因分析：
（1）封闭液过期、浓度不足或者封闭时间不够；
（2）抗体使用浓度过高，导致非特异性结合；
（3）洗涤次数不足，或者洗涤液过于温和；
（4）转膜液使用次数过多或者放置太久存在细菌污染；
（5）曝光强度过高或者曝光时间太久，增加背景信号；
改进方法：
（1）使用新鲜配制的封闭液，并适当延长封闭时间；
（2）按推荐比例稀释抗体或者更大比例进行抗体稀释（可以调整的）；
（3）洗膜尽量遵循短时多次的原则，洗涤液添加Tween 20，增加洗涤效果；
（4）使用新鲜的转膜液，不用时置于-20℃保存（有絮状物沉淀就别用了）；
（5）优化显影参数（机器是死的，人是活的，调整一下不行嘛）；
丑拒条带第 7 种：Marker 显出条带（其实问题不大）
原因分析：
（1）抗体与 Marker 存在非特异性结合； 改进方法：
（1）更换抗体或者 Marker；
丑拒条带第 8 种：出现多条非特异性条带
原因分析：
（1）抗体降解、效价差、浓度过高或者孵育温度高等；
（3）PVDF 膜封闭时间不足，或者封闭液失效；
（4）洗膜时间过短或者次数不足，导致 PVDF 膜上残留一抗；
（5）电泳缓冲液多次使用，回收使用的电泳缓冲液存在细菌污染；
（6）显影时曝光时间过久；
改进方法：
（1）使用新鲜的高效价比的抗体，并根据说明书推荐浓度进行一抗稀释后使用；
（2）一抗孵育时可在 4℃孵育过夜，低温有利于降低非特异性结合；
（3）使用 5%的 BSA 或者新鲜配制的脱脂奶粉进行封闭，适当延长封闭时间；（4）增加 PVDF 膜洗涤次数，可以短时多次进行洗涤，并且在洗涤液中加入 Tween-20 有助于洗去非特异性结
合；
（5）适当调整曝光强度和曝光时间参数，达到最优效果；
丑拒条带第 9 种：边缘条带翘边（就它特殊）
原因分析：
（1）边缘效应，胶的最左侧或最右侧加蛋白样品导致； （2）玻璃板右/左下侧有缺口，导致电泳速度不均一； 改进方法：
（1）尽量将蛋白样本加到凝胶中间，两端用Marker 配平或者蛋白Loading 补齐；
（2）更换新的玻璃板，确保电泳槽不存在漏液；
丑拒条带第 10 种：条带挺好的，但膜上有“脏东西 ”
原因分析：
（1）PVDF/NC 膜存在污染或者转膜时触碰到膜表面； （2）封闭液污染或者有不可溶颗粒；
（3）膜未被充分活化或者活化后膜又出现干燥情况； 改进方法：
（1）转膜时用镊子夹住一角，不要碰触膜表面；
（2）更换封闭液，清洗封闭盒，避免不可溶颗粒或者损伤膜表面；
（3）保证膜充分活化，并且活化浸入转膜液保湿；
以上几种条带，除了美观性差一些，但好歹还能用来分析，勉强用来作图展示，接下来的 问题就只能含泪重做了。
丑拒条带第 11 种： 条带亮度不均一，忽明忽暗（一闪一闪亮晶晶？）
原因分析：
（1）蛋白浓度过高，发光底物消耗过快；
（2）发光底物加入过少，覆盖不均匀；
（3）转膜时夹的较松，接触不良，导致蛋白转移不均匀；
改进方法：
（1）正式实验前摸索蛋白上样量；
（2）增加发光液使用量，确保完全覆盖 PVDF 膜；
（3）确保转膜结构松紧合适，保证蛋白均匀充分转移至 PVDF 膜；
丑拒条带第 12 种：条带中间出现边缘规则空白泡泡（blueblueblue!）
原因分析：
（1）转膜时“滤纸-PVDF 膜-蛋白凝胶-滤纸 ”中存在气泡，电流无法将蛋白分子转移至 PVDF 膜导致。
改进方法：
（1）转膜时将转膜缓冲液倒入托盘，在托盘中铺放“滤纸-PVDF 膜-蛋白凝胶-滤纸 ”结构， 尽量使转膜缓冲液没过凝胶；
（2）可以在铺放滤纸和 PVDF 膜时，将滤纸或 PVDF 膜完全浸湿，从一侧轻轻放下，铺放的同 时缓慢在蛋白凝胶表明加入转膜缓冲液；
丑拒条带第 13 种：条带连在一起手拉手（秀恩爱，死得快）
原因分析：
（1）蛋白上样量过大导致条带过浓；
（2）蛋白样品盐离子浓度过高，影响蛋白迁移速率；
（3）抗体浓度过高，孵育时间过久，曝光时间长导致显影条带过浓；
改进方法：
（1）降低蛋白上样量，进行预实验摸索上样量；
（2）稀释蛋白样本，降低样品盐离子浓度；
（3）按照说明书使用抗体，缩短孵育时间，调整曝光参数；
丑拒条带第 14 种：条带拖着长长的尾巴（假装哈雷彗星呢）
原因分析：
（1）蛋白上样量太大或者一抗浓度和孵育时间过长；
（2）蛋白出现轻微降解；
（3）样品溶解不佳或者蛋白形成聚集体，影响蛋白迁移；
（4）分离胶浓度过高，导致蛋白迁移不均匀；
（5）电泳缓冲液配制问题影响蛋白迁移速率（尤其是pH）；
（6）电泳时电压过高或者电泳过久，产热严重；
改进方法：
（1）调整蛋白上样量（建议每孔不超过 30 μg）和抗体孵育条件；
（2）提取蛋白时在冰上操作，并加入蛋白酶抑制剂（这点大家都知道的啊），提取蛋白后， 将蛋白分装后保存到-80℃ , 避免反复冻融；
（3）使用不同的样品处理方法，如改变样品缓冲液的组成或增加样品促溶剂，上样前进行离 心操作；
（4）根据蛋白分子量大小选择配制浓度的分离胶（分子量差别过大时可以尝试梯度胶）；
（5）配制新鲜的电泳缓冲液，尤其是检查各种试剂是否过期（长毛的Tris-HCl 真的就别用了 呀！）
（6）调整需要进行长时间电泳时，可以考虑加个冰袋；
丑拒条带第 15 种： 条带反白，空心化（它心空，你心痛）
原因分析：
（1）蛋白浓度过高或者上样量过大；
（2）抗体浓度过高，条带信号过强；
（3）曝光强度过高或者时间过长；
（4）封闭不充分，导致抗体与 PVDF 膜非特异性结合；
（5）转膜时 PVDF 膜出现干燥的情况；
（6）发光液过于敏感，导致条带信号过强；
改进方法：
（1）调整蛋白浓度或者上样量；
（2）根据抗体说明书进行稀释和使用；
（3）调整并优化显影时的参数；
（4）封闭时确保封闭液完全没过 PVDF 膜；
（5）转膜时确保 PVDF 膜完全活化，并用转膜液进行润洗浸湿；
（6）更换发光液或者对发光液进行稀释后使用（TBST 稀释）；
丑拒条带第 16 种：条带有重影（眼花了？？）或者呈现梳子状
原因分析：
（1）蛋白凝胶配制不均匀，条带迁移速率不同；
（2）PVDF 膜过期或者褶皱过期；
（3）蛋白凝胶配制过久，水分蒸发导致成分不均匀；
改进方法：
（1）充分混匀制胶液各种组分；
（2）更换新的 PVDF 膜；
（3）使用新鲜配制的蛋白凝胶（配制的胶一般水封保存 2-3 天内就要用掉）；
丑拒条带第 17 种：条带弱（若隐若现玩朦胧美吗？）
原因分析：
（1）蛋白表达量过低或者上样量太少；
（2）抗体效价低或者稀释比例过大；
（3）转膜效果差，转移到膜上的蛋白太少；
（4）小分子蛋白转膜时间过久，导致部分蛋白转出膜；
改进方法：
（1）增加蛋白上样量；
（2）缩小抗体稀释比例（1:500-1:1000）；
（3）使用新鲜配制的转膜液，避免转膜液失效导致转膜不彻底；
（4）缩短小分子蛋白转膜时间；
丑拒条带第 18 种：条带不规则，呈现毛玻璃状（被猫抓了？）
原因分析：
（1）电泳电压过低，蛋白泳动速度过低出现弥散；
（2）转膜时夹的或者太松或太紧导致凝胶接触不良或者变形；
（3）转膜时间长或者转膜电流大，放热过多导致凝胶变形；
（4）PVDF 膜的湿润不均匀、膜上存在污染物、膜过期、损坏等；
（5）转膜滤纸多次使用，纸屑过多，影响转膜过程；
（6）蛋白转膜液试剂配比错误或者包含杂质过多，影响转膜过程；
改进方法：
（1）使用新鲜的电泳缓冲液，根据蛋白分子量大小设置电泳时的电压（浓缩胶一般为 80 V， 分离胶一般为 100-120 V）。
（2）使用新鲜配制的转膜缓冲液，使用前放在-20 ℃进行预冷处理，根据蛋白分子量大小设 置转膜时的电流（200 A），转膜时将转膜槽放入冰水中，并加入冰袋；
（3）转膜时保持全程低温，对于大分子量蛋白，转膜期间可更换冰袋；
（4）使用品质有保证的 PVDF 膜以及配套的完好的转膜设备，避免转膜夹夹的过松或者过紧， 使 PVDF 膜和蛋白凝胶的紧密贴合；
（5）滤纸尽量不要多次使用，一次完美的实验节省下来的材料费和时间远大于滤纸的费用；
丑拒条带第 19 种：条带飘逸不定（用了飘柔？）
原因分析：
（1）电泳时蛋白降解或者弥散严重；
（2）转膜时夹的不够紧，凝胶与 PVDF 膜出现滑动或者接触不良；
（3）转膜时电压或者电流不稳定或者放热过多；
（4）PVDF 膜老化或者损坏，导致蛋白转膜不稳定；
改进方法：
（1）蛋白提取和保存时严格按要求进行（翻看上面的建议）；
（2）转膜时使用新的转膜夹（坏了就别将就了），建议使用 3 层滤纸；
（3）更换新的转膜电源，避免转膜电流不稳定；转膜期间更换冰袋，避免转膜过程放热过多；
（4）保证 PVDF 膜没有褶皱损坏，并且彻底活化；
丑拒条带第 20 种：显影时膜上存在黑色斑点
原因分析：
（1）转膜液未完全溶解或者存在不可溶颗粒物；
（2）PVDF 膜过期损坏，避免存在颗粒；
（3）封闭用的 5% BSA 或者脱脂奶粉未完全溶解或者存在不溶颗粒；
（4）二抗多次使用，导致过期或者残留杂质；
（5）抗体和封闭物出现非特异性结合（常见于脱脂奶粉）
改进方法：
（1）使用新鲜转膜液，确保转膜液充分溶解；
（2）使用新鲜 PVDF 膜，确保膜表面光滑；
（3）充分溶解封闭液，可以置于摇床上进行充分溶解后再封闭；
（4）二抗使用 2-3 次即可更换，每次洗膜时适当增加洗膜次数；
（5）更换封闭液成分，例如使用BSA 进行封闭；
丑拒条带第 21 种：没有条带（天塌了）
原因分析：
（1）蛋白表达过低，上样量太少；
（2）蛋白样本降解（膜会看起来比较脏）；
（3）转膜不充分（压根就没转过去蛋白，看看 Marker）
（4）一抗失效或者降解（膜也会看起来黑黢黢的）；
（5）二抗种属使用出错；
（6）发光液失效或者用量不足；
（7）显影参数设置错误、膜放反了（别笑，真的有可能）；
改进方法：
（1）增加蛋白上样量，或者进行刺激提高蛋白表达量；
（2）严格遵守蛋白提取实验操作流程；
（3）根据 Marker 分析转膜过程是否出错；
（4）更换新的一抗（看一下膜是纯白还是黑黢黢的分析是否抗体问题）；
（5）根据一抗种属匹配二抗种属（别搞混了）；
（6）更换发光液（发光液也会过期失效的）；
（7）仔细检查显影参数，看看膜有没有放反；
1、蛋白提取
（1）蛋白提取时添加蛋白酶/磷酸酶抑制剂，全程低温进行，避免蛋白降解；
（2）蛋白煮样后取上清，分装后保存到-80℃ , 避免反复冻融；
2、凝胶制备
（1）制备蛋白凝胶前，玻璃板和梳子刷洗干净无残留，晾干后使用；
（2）制备时，尽量使用新鲜的试剂进行配制，避免试剂过期影响蛋白电泳效果，充分混匀制 胶液后沿一侧缓慢加入玻璃板中，每次移液枪中保留少许制胶液，避免玻璃板中产生气泡；
（3）分离胶配置完成后，最好只用无水乙醇进行压平，减少气泡并保证凝胶成分分布均匀；
（4）制备完成后，蛋白凝胶充分凝固后使用，尽量现制现用。暂时不用的凝胶可以放入密封 袋中，加入少许纯净水保存于4℃。
注意：
（1）Tris-HCl 溶液容易过期并产生沉淀，配制完之后使用滤膜进行过滤后置于 4℃进行保存；
（2）低温条件下 10% SDS 会析出，使用前必须充分溶解，避免浓度不足；
（3）过硫酸铵（AP）极易过期，每次少量配制，3-4 周后更换新鲜 AP 溶液；
（4）温度越低，蛋白凝胶凝固越慢；冬天可适当增加TEMED 使用量；
3、蛋白电泳
（1）电泳缓冲液最好现用现配，充分混匀使用；若需回收，可将缓冲液静置后回收上清；
（2）合理设置电泳参数，浓缩胶电压 60-80 V，分离胶电压 80-120 V，有助于提高蛋白分辨 率和条带美观性；
（3）使用浓度合适的凝胶进行电泳（蛋白越大，所需分离胶浓度越低）；
（4）上样前一定检查电泳槽是否漏液。如果不放心，可以在电泳时在内外槽中间加入装满水 的 15 mL 离心管，使外槽中电泳液没过内槽；
4、蛋白转膜
（1）转膜缓冲液现用现配，配制时确保试剂有效并充分溶解，配置后放入-20℃预冷备用；
（2）选择合适的转膜用的膜（NC 膜或者 PVDF 膜），二者主要区别如下：
NC 膜：适用范围（0.45 μm > 20 kDa；0.2 μm > 7 kDa；0.1 μm < 7 kDa）、灵敏度高、 背景低、无需甲醇激活、价格较低；但 NC 膜与蛋白结合能力较弱，干燥的 NC 膜比较脆弱，使 用时需小心操作；
PVDF 膜：适用范围（0.45 μm > 20 kDa；0.2 μm ≤7 kDa）、灵敏度高、背景相对较高、 与蛋白结合能力强，机械强度高；但 PVDF 膜价格较贵，并且使用时需提前使用甲醇活化；
PS：PVDF 膜是疏水性的，甲醇浸泡有助于提高膜的润湿性和亲水性，增强与蛋白质的结合能 力。
（3）转膜时不可夹的过紧或者过松，“三明治 ”结构一般推荐为：海绵-3 层滤纸-凝胶-膜-3 层滤纸-海绵；
（4）转膜时避免“三明治 ”结构中存留气泡，可以边铺放边泼洒转膜缓冲液；
（5）转膜时需确保处于低温状态，可在转膜槽周边加入冰袋，并且转膜期间更换冰袋；
5、封闭和抗体孵育
PS:小知识之封闭的原理：
在 NC 膜或者 PVDF 膜表面有许多空洞，通过电转或包被能将凝胶上的蛋白转移到膜上，蛋 白以堆积和吸附的方式结合于膜表面。由于蛋白并非连续的，膜上有许多的区域未被填充，封 闭时便是利用封闭液中的抗体将未被目的蛋白填充的区域覆盖，对膜进行封闭，避免抗体结合 产生背景。
（1）封闭时选择合适的封闭液，常用封闭液特点如下：
脱脂奶粉：价格低，效果好，使用广泛；但由于牛奶中的酪蛋白能与磷酸化抗体结合，导致背 景升高，因此在进行磷酸化检测时不推荐使用；
BSA：常用的封闭试剂之一，从牛血清中纯化所得，成分单一，不易出现非特异性结合；但如 果免疫原能够偶联 BSA，则会导致背景升高；
酪蛋白：与 BSA 作用类似，中性和碱性条件下带有负电性，与膜（一般带正电荷）有吸附作用 封闭效果好；
动物血清：牛、兔、小鼠等动物的血清，价格较贵，通过内部的免疫球蛋白与膜上的反应位点 结合，阻止抗体的非特异性结合，使用时需注意避免与一抗同种属；
鱼明胶：冷水鱼中提纯的明胶，由于不含哺乳动物血清蛋白，因此不会与哺乳动物抗体发生交 叉反应，能有效减少背景信号，适用于对背景噪音敏感的实验；但由于鱼明胶中含有内源性生 物素，因此不能与亲和素-生物素检测系统一起使用。
（2）一抗孵育时可选择 4℃过夜孵育，低温有助于减少非特异性结合，降低背景噪音；
（3）一抗和二抗种属必须相匹配，并且使用合适的稀释比例；
（4）抗体保存时需严格遵守建议保存条件，大多数抗体都是-20℃保存。
注意，由于抗体中包含甘油，-80℃低于甘油的冰点，因此有些抗体并不适用于-80℃保存。
6、洗涤与显影
（1）洗涤时尽量采用短时多次的方法进行洗涤，降低非特异性结合和背景噪音（若条带太弱 的话就酌情减少洗涤次数）；
（2）洗涤液中加入Tween 20 有助于洗去非特异性结合；
（3）显影时调整曝光参数，如光强和曝光时间，有助于获得较好的图片质量。
综上，小橙子为大家分析了常见的 WB 实验中“丑拒 ”的条带类型，并分享了一些小小的 经验，希望大家显影都能获得理想的趋势和漂亮的条带。
