图 1.转膜的物料顺序

Western blot 实验中，转膜的最佳条件因蛋白分子量、膜类型、转膜方法等因 素而异，以下是一些常见的最佳条件参考：

01、转膜方法及设备

湿转法：是比较常用的方法，较为稳定。一般使用转膜槽，将转膜夹放入转膜槽 中，确保阴极板连接到缓冲槽的负极，阳极板连接到正极。转膜过程中，可将加 满转膜缓冲液的转印槽置于冰浴中缓解发热现象。

半干转法：转膜时间短、速度快，所需缓冲液更少，但干燥条件下转膜容易失败。 使用半干转膜仪，将凝胶、膜和滤纸等组装好后，直接在电极板之间进行转膜。

膜的选择：PVDF 膜适用于大多数蛋白的转印，结合能力较强，但需要在甲醇中  激活；硝酸纤维素膜价格相对便宜，但结合能力稍弱。对于小分子蛋白（<50kDa）， 可选用 0.22 μm 孔径的膜；对于常规中小分子量蛋白（25-70kDa），可选用 0.45 μm 孔径的膜；对于大分子蛋白（>50kDa），则选用 0.45 μm 或更大孔径的膜。

滤纸和海绵：滤纸应选择质量好、吸水性强且无杂质的，其大小要略大于膜和凝 胶。海绵要厚度适中、弹性好，以确保转膜夹夹紧后各层之间紧密接触，无气泡。

03、转膜缓冲液

成分及作用：通常包含  Tris（三羟甲基氨基甲烷）提供 pH 缓冲能力，SDS（十 二烷基硫酸钠）有助于保持蛋白质在转移过程中的变性状态，防止重新折叠，甲 醇可增加蛋白质与膜的结合，提高转膜效率，但对于大分子蛋白，可适当降低甲 醇浓度至 10% 或更低，防止蛋白沉淀。

pH 值：转膜液的  pH 值通常在 8.3 左右，使用前需检查并确保其在适当范围 内。

04、转膜条件

电压和电流：小分子量蛋白质一般需要更高的电压（如  100-200V）和较短的时 间（如 30 分钟到 1 小时）；大分子量蛋白质则需要较低的电压（如 30-50V） 和较长的时间（如过夜）。也可采用恒流法，对于常规分子量蛋白（25-70kDa）， 湿转时可选用 300mA，转膜 30min 左右；对于大分子蛋白，可延长转膜时间至  60-90min 或更长，亦可在转膜液中加入适量 SDS 至终浓度 0.5‰左右；对于小

分子蛋白，可去除缓冲液中的 SDS，对于 20kDa 以下小分子量蛋白，可选用 200mA，20-25min 或 300mA，15-20min，亦可增加甲醇含量至 25%。

转膜时间：需根据蛋白分子量大小、电压、电流及转膜方法等因素综合确定。一 般来说，湿转法转膜时间相对较长，半干转法转膜时间较短。如小分子蛋白湿  转  30min 左右，大分子蛋白湿转可能需要 1.5-2 小时甚至过夜，半干转一般 在 30-60min 左右。

05、其他注意事项

避免气泡：在装配转膜夹时，要确保所有层都紧密接触，没有气泡，可使用玻璃 棒轻轻滚动以驱赶残留的气泡。

保持湿润：在整个转膜过程中，膜和凝胶始终要保持湿润，避免干燥。

防止污染：尽量避免用手直接接触膜，以免造成污染。

转膜验证：转膜完成后，可用丽春红染液对膜进行染色，以判断转膜效率。 转载自微信公众号“生物奇迹 ”；