实时荧光定量 PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）是一种由传统 PCR 技术发展而来的 先进分子生物学方法。它通过在 PCR 反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号的积 累来实时监测整个 PCR 过程。最终，通过分析 CT 值和标准曲线进行未知模板的定量评估。相 较于传统 PCR，qPCR 不仅保持了快速和灵敏的特点，还具备更高的特异性、实时动态监测、以 及高精度的定量能力，使其成为基因表达分析和检测的强大工具。这使得 qPCR 技术在医学诊 断、研究和生物技术应用中广泛利用，从而提供更为可靠的数据支持。
一、qPCR 化学原理-染料法
①SYBR Green 是一种高灵敏度的非特异性双链 DNA 荧光染料，具有绿色激发波长。它通 过非特异性地结合在双链 DNA（dsDNA）双螺旋的小沟区域来发挥作用。游离的 SYBR Green 本身仅发出极弱的荧光信号，但在 PCR 扩增过程中，当双链 DNA 形成时，SYBR Green 与 之结合，荧光信号倍增至数千倍。所得到的荧光信号强度与 dsDNA 的浓度成正比，这一 信号被仪器检测并记录下来，形成“扩增曲线 ”，反映出反应体系中 dsDNA 的浓度。
②SYBR Green 不仅能与特异性扩增产物结合，还可能与引物二聚体和非特异性扩增的
dsDNA 结合，从而影响结果的准确性。因此，在扩增反应结束后，必须对生成的 dsDNA 进行分析。通过升温使双链 DNA 解链，SYBR Green 染料随之脱落，荧光信号下降，进而 形成温度与荧光强度的“熔解曲线（Melting Curve） ”， 以判断体系中是否存在引物二 聚体或非特异性扩增。
③SYBR Green I 染料法因其操作简便、灵敏度高和成本低，在 DNA 及 RNA 定量、基因表 达研究、转基因生物研究等领域得到广泛应用。通过此方法，科研人员能够有效地进行 准确的基因分析。
1.变性步骤（Denaturation Step）：在这个阶段，双链 DNA 被加热至高温，导致解链成 单链。而此时游离的 SYBR Green 荧光信号极为微弱，因为它主要与双链结构结合发光。
2.退火步骤（Annealing Step）：此时，DNA 引物退火，合成新的双链 DNA，SYBR Green I 以非特异性方式结合在双链 DNA 的小沟中，从而发出强烈的荧光信号。仪器在此阶段采 集荧光信号，并将荧光强度记录为 DNA 总量的测定依据。
3.延伸步骤（Extension Step ）：反应完成后进行熔解曲线分析，通过逐步升温，双链 DNA 解链，SYBR Green 染料脱离，导致荧光信号逐渐降低。此分析帮助检测过程中可能 存在的引物二聚体或非特异性扩增产物。
二、qPCR 化学原理-探针法
TaqMan 探针由一个 5 ’端标记有荧光报告基团和一个 3 ’端标记有淬灭基团的寡核苷酸 序列组成，这个序列能特异性结合目标基因。当探针完整时，报告基团的荧光信号被淬 灭基团吸收，仪器无法检测到荧光。
在 PCR 扩增过程中，模板 DNA 变性解链，TaqMan 探针特异性结合于目标基因区域。Taq 酶的 5 ’-3 ’核酸外切酶活性使其在延伸至探针结合位点时水解探针，从而分离荧光报告 基团和淬灭基团，导致荧光信号的释放。荧光信号的强度与扩增产生的双链 DNA 浓度成 正比，仪器采集这些信号形成“扩增曲线 ”，通过其强度反映 DNA 浓度。
1.变性步骤（Denaturation Step）：一条寡核苷酸探针，5'端标记为报告基团（Reporter, R） ，3'端标记为淬灭基团（Quencher, Q）。
2.探针杂交（Probe Hybridization） ：TaqMan 探针特异结合于目标基因。
3.延伸/探针水解（Extension/ Probe Hydrolysis） ：Taq 酶的 5'-3'外切酶活性水解探 针，分离出荧光基团并释放荧光。
4.荧光发射（Fluorescence Emission）：释放的荧光强度与结合探针的 DNA 总量成正比， 实现高精度的定量分析。
三、不同荧光物质的特点
四、qPCR 实验流程（RNA 提取）
1.样本采集与保存：RNA 提取的首要步骤是样本采集和妥善保存。对于细胞和组织样本， 需在采集后尽快提取 RNA 以防止其降解。针对血液样本，建议使用 RNA 稳定剂或立即进 行 RNA 提取。样本的保存温度和时间应依据不同实验目标作出相应调整。
2.样本处理：样本前处理旨在去除细胞碎片、蛋白质及 DNA 等杂质，以提高 RNA 的纯度。 常见的处理方法包括离心、过滤和洗涤等技术。
3.样本裂解：样本裂解是破坏细胞膜，使 RNA 释放至溶液中的关键过程。机械裂解、化 学裂解和热裂解为常用的方法。
4.提取纯化：提取后，RNA 需进行纯化以去除残余 DNA、蛋白质及其他杂质。RNA 纯化试 剂盒、硅胶柱以及磁珠等方法均可用于这一步骤。使用 RNase-free 试剂和器具，并避免 在纯化过程中导致 RNA 降解是至关重要的。
5.质量检测：提取后的 RNA 需进行质量检测， 以确保其完整性和高纯度。生物分析仪和 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测工具，可有效评价 RNA 样本的质量。
五、qPCR 实验流程（逆转录）
1.基因组 DNA 清除：基因组 DNA 的残留可能导致 qPCR 结果不准确。为确保结果的可靠性， 建议使用配有 gDNA 去除组分的逆转录试剂， 以高效清除样品中残余的基因组 DNA。
2.逆转录反应：逆转录反应是将 RNA 转录为 cDNA 的关键步骤。反应体系通常包括 RNA 模 板、随机引物、逆转录酶及相应缓冲液等组分。逆转录反应的温度和时间应根据所使用 的逆转录酶进行优化， 以获得最佳的酶活性和转录效率。
六、qPCR 实验流程
1.引物设计
qPCR 染料法中的引物设计原则与其他 PCR 反应类似，主要需考虑以下因素：
①引物长度：应为 18-24 个碱基对， 以确保结合的特异性和效率。
②引物 Tm 值：应在 55-65℃之间，保证在反应温度下的高效结合。
③引物特异性：应避免与非目标序列进行互补，确保准确扩增。
④引物末端修饰：可增加引物的特异性和稳定性，提高实验结果的可靠性。
2. 内参选择
内参是用来校正样品间差异的参考基因，应具备以下特点：
①表达稳定性：在不同样品中保持稳定的表达水平。
②检测易度：与 目标基因具有相似的检测难易程度。
③抗干扰性：不受实验条件影响。常用的内参基因包括 GAPDH、Actin、Tublin 等。
3.模板用量
优化 qPCR 实验中 cDNA 模板的稀释度需要预实验确定最佳稀释倍数。步骤：
①准备不同浓度的 cDNA 稀释液，如原液、1:10、1:100。
②进行 qPCR 反应并记录 Ct 值。
③选择 Ct 值在 18-28 范围内的稀释倍数为佳。
4.程序设置
qPCR 程序通常包括以下步骤（具体需参照试剂说明书）：
①预变性：95℃ , 5 分钟。
②循环反应：95℃ , 30 秒；55℃ , 30 秒；72℃ , 30 秒；共 40 个循环。
循环反应可采用两步法或三步法：两步法将退火和延伸合并，简化流程，适用于一般实 验；若模板浓度低或扩增效率低，可考虑三步法以优化结果。
免责声明： 本号对所有原创、转载文章陈述与观点均保持中立， 内容仅供读者学习和交流 。文章、 图片等版权归原作者享有，如有侵权 ，请留言联系更正或删除。
