有可能最全的 PCR 类型总结：36 种 PCR 类型及其定义、原理和用途

有可能最全的 PCR 类型总结：36 种 PCR 类型及其定义、原理和用途

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1. 扩增片段长度多态性 PCR（Amplified fragment length polymorphism PCR，AFLP PCR）

这是一种基于 PCR 的技术，利用消化的 DNA 片段的一段选择性扩增来为目标基因组生成独特的指纹图谱。该技术可以快速为任何生物体生成大量标记片段，而无需事先了解基因组序列。AFLP PCR 使用限制性内切酶消化基因组 DNA，并允许接头连接到片段的粘性 末端。然后选择一部分限制性片段，使用与衔接子序列互补的引物进行扩增。扩增的序列在琼脂糖凝胶电泳变性时分离和可视化。AFLP PCR 用于多种应用，如评估物种内或密切相关物种之间的遗传多样性，推断种群水平的系统发育和生物地理模式，生成遗传图谱和确定品种之间的相关性。

2. 等位基因特异性 PCR（Allele-specific PCR，AS-PCR）AS-PCR 是一种基于等位基因

特异性引物的技术，可用于分析单核苷酸多态性。AS-PCR 也称为（amplificationrefractory mutation system）ARMS-PCR，对应于对两个不同等位基因使用两种不同的引物。一种是对正常 PCR 耐热的突变引物组，另一种是对突变 PCR 反应耐热的正常引物

组。这些引物的 3'末端经过修饰，使得一组引物可以扩增正常等位基因，而其他引物可以扩增突变等位基因。这种错配允许引物扩增单个等位基因。广泛应用于镰状细胞性贫血、地中海贫血等单基因点突变检测。也用于 ABO 血型基因型的直接测定。

3. Alu PCRAlu PCR 是一种快速简便的 DNA 指纹图谱技术，基于对 Alu 重复元件包围的许多基因组位点的同步分析。Alu 元件是短段 DNA，最初以黄体节杆菌（Alu）限制性核酸内切酶的作用为特征。Alu 元件是最丰富的转座因子之一，在整个人类基因组中都有发现，它们在进化中发挥作用，并已被用作遗传标记在 Alu PCR 中，使用与这些序列互补的两 个荧光染料标记的引物进行 PCR，然后通过 Alu 插入已用于多种遗传性人类疾病和各种 形式的癌症。因此，这种 PCR 在检测这些疾病和突变中起着至关重要的作用。

4. 组装 PCR（Assembly PCR）组装 PCR 是一种从多个较短片段组组装出大 DNA 寡核苷酸的方法。在 PCR 中，使用的寡核苷酸大小为 18 个碱基对，而在组装中，使用高达 50bp 的 PCR 长度以确保正确杂交。在 PCR 循环中，寡核苷酸与互补片段结合，然后被聚合酶填充。因此，该 PCR 的每个循环都会随机增加各种片段的长度，具体取决于哪些寡核苷酸相互找到。组装 PCR 用于提高所需蛋白质的产量，也可用于产生大量 RNA 用于结构或生化研究。

5. 非对称 PCR（Asymmetric PCR）非对称 PCR 是 PCR 的一种变体，用于优先扩增原始 DNA 的一条链而不是另一条链。非对称 PCR 与常规 PCR 的不同之处在于所选链的引物量过大。随着非对称 PCR 的进行，较低浓度的限制引物被定量掺入新合成的双链 DNA 中并用完。

因此，在耗尽限制性引物后，从过量引物形成靶向单 DNA 链的线性合成。当只需要扩增两条互补链中的一条时，例如在测序和杂交探测中，它非常有用。

6.冷 PCR（COLD PCR）基于低温变性的冷 PCR 是一种新型 PCR 形式，可选择性地从野生型 和含突变体（或包含变体）序列的混合物中扩增低丰度 DNA 变体，而不管突变类型或在 扩增子上的位置如何。该方法基于对临界温度的修改，在该温度下，含突变的 DNA 优先于野生型 DNA 退火。变性后有一个中间退火过程，允许野生型和突变等位基因杂交。这种错配会略微改变 dsDNA 的退火温度。这些异源双链体会熔化并用作模板。因此，更大比例的次要变异 DNA 将被扩增并可用于后续轮次的 PCR。PCR 在肿瘤标本突变的检测中起着至关重要的作用，尤其是在异质性肿瘤和体液中。该 PCR 还有助于评估手术或化疗后的残留病灶以及疾病分期和分子分析，以便为个体患者提供预后或定制治疗。

7. 菌落 PCR（Colony PCR）菌落 PCR 是一种通过设计插入的 DNA 特异性引物来鉴定插入

质粒中的目标 DNA 的方法 。含有质粒的细菌菌落可以使用两组引物直接扩增。第一组是扩增插入序列的插入特异性引物，另一组是载体特异性侧翼引物，用于扩增插入的 DNA 以外的质粒 DNA。取细菌菌落并直接加入到含有所有其他 PCR 试剂的预混液中。菌落 PCR 的主要应用是鉴定正确的连接以及将插入的 DNA 插入细菌以及酵母质粒中。

8. 聚合酶链式反应（PCR）是一种用于 DNA 复制的系统，可在短短几个小时内将“ 目标 ” DNA 序列选择性扩增数百万倍。PCR 能够使用 DNA 聚合酶合成特异性 DNA 片段，该酶参与细胞遗传物质的复制。这种酶合成 DNA 的互补序列，因为一个小片段（引物）连接到选择开始合成的特定位点的一条 DNA 链。引物限制了要复制的序列，结果是扩增了数十亿个拷贝的特定 DNA 序列。常规 PCR 应用于选择性 DNA 分离、DNA 扩增和定量、医学和诊断方法、传染病诊断、法医研究和研究领域。

9. 数字 PCR（Digital PCR，dPCR）数字 PCR （dPCR）是一种定量 PCR 技术，为测量样品中存在的 DNA 或 RNA 量提供了一种灵敏有效的方法。对于 dPCR，在扩增步骤之前，将 初始样品混合物分成大量单独的孔，使每个孔中存在或不存在靶序列 。根据扩增反应孔 中是否存在荧光，计算原始样品中存在的靶标的绝对数量。具有荧光信号的孔被视为阳性，评分为“ 1 ”，而没有荧光信号的孔为阴性，评分为“0 ”。然后通过泊松统计分析 确定初始样品中存在的目标序列的浓度。dPCR 用于测定各种临床标本中 DNA 和 RNA 病毒、细菌和寄生虫的总数，主要是在没有经过充分校准的标准品的情况下。

10. 快速循环 PCR（Fast cycling PCR）快速循环 PCR 是一种基于 PCR 的技术，可扩增特异性 PCR 产物，并显著缩短循环时间。该过程的原理与常规 PCR 相同，唯一的区别是 扩增时间。该 PCR 中使用的缓冲液提高了 Taq DNA 聚合酶对短单链 DNA 片段的亲和力，

将引物成功退火所需的时间缩短至仅 5 秒。快速循环 PCR 对于需要快速循环的过程至关重要，也有助于快速诊断疾病和突变。

11. 高保真 PCR（High Fidelity PCR）高保真 PCR 是一种经过修饰的 PCR 方法，它利用 错误率低的 DNA 聚合酶，可在目标 DNA 的复制中实现高度的准确性。在扩增过程中，这种酶对正确的三磷酸核苷具有显著的结合亲和力。在聚合酶活性位点结合不正确的情况下，由于活性位点复合物的结构，掺入速度会减慢。高保真扩增对于结果取决于正确 DNA 序列的实验（如克隆、SNP 分析、NGS 应用）至关重要。

12. 高分辨率熔解 PCR（High-Resolution Melt PCR，HRM PCR）这是一种非常强大的技术，用于检测双链 DNA 样品中的突变、多态性和表观遗传差异。与其他基因分型技术

（如测序和 Taqman SNP 分型）相比，它具有极大的成本效益。这使其成为大规模基因分型项目的理想选择。它快速而强大，因此能够快速准确地对大量样品进行基因分型。通 过高质量的 HRM 检测，非遗传学家可以在任何可以使用支持 HRM 的实时荧光定量 PCR 机 器的实验室中进行强大的基因分型。

13. 热启动 PCR（Hot start PCR）热启动 PCR 是常规聚合酶链式反应（PCR）的一种新型形式，可减少由于室温下非特异性 DNA 扩增而导致的不需要的产物的出现和引物二聚体的形成。热启动 PCR 的基本原理是从反应混合物中分离一种或多种试剂，直到混合物在 加热时达到变性温度。热启动 PCR 可显著降低非特异性结合、引物二聚体的形成，并且通常会提高产物产量。它还需要更少的工作量并降低污染风险。

14. 原位 PCR（ In-situ PCR）原位 PCR 是一种有效的方法，可检测冷冻或石蜡包埋的细胞或组织切片中微量的稀有核酸序列，以将这些序列在细胞内区室化。该方法涉及保留 细胞形态的组织固定，然后用蛋白水解酶处理，为 PCR 试剂提供作用于目标 DNA 的入口。靶序列通过试剂扩增，然后通过标准免疫细胞化学方案进行检测。原位 PCR 适用于传染病的诊断、DNA 的定量、微量 DNA 的检测，并广泛用于器官发生和胚胎发生的研究。

15. 序列间特异性（Intersequence specific PCR，ISS PCR）序列间特异性 PCR（或

ISSR-PCR）是一种 DNA 指纹图谱分析方法，它使用从整个基因组中重复的特定片段中选 择的引物来产生独特的指纹图谱。该技术使用微卫星（通常为 16-25 bp 长）作为靶向多个基因组位点的单个引物 PCR 反应中的引物，主要扩增不同大小的 SSR 间序列。ISSR PCR 可用于基因组指纹图谱、遗传多样性和系统发育分析、基因组图谱和基因标记。

16. 反向 PCR（ Inverse PCR）是聚合酶链反应的众多变体之一，用于在仅知道一个序列时扩增 DNA。常规 PCR 需要与靶 DNA 的两个末端互补的引物，但反向 PCR 允许进行扩 增，即使只有一个序列可用，也可以从中设计引物。反向 PCR 涉及一系列限制性酶切，

然后进行连接，这会产生一个环状片段，然后可以通过已知序列的单个片段引发 PCR。然后，与其他 PCR 过程一样，DNA 被温度敏感的 DNA 聚合酶扩增。反向 PCR 对于测定宿主 DNA 中各种转座子和逆转录病毒的插入位置特别有用。

17. 指数后线性 PCR(Linear-After-The-Exponential PCR，LATE PCR）LATE PCR 是非对称 PCR 的改进，它使用比过量引物熔解温度更高的限制性引物，当限制性引物浓度在反应中期降低时保持反应效率。LATE-PCR 从指数期开始，其中扩增效率与常规 PCR 相似。一旦限制性引物耗尽，反应突然切换到线性扩增，单链产物继续进行许多额外的热循环。

18. 连接介导的 PCR（Ligation mediated PCR）连接介导的 PCR 是常规 PCR 的一种改进形式，最初只需知道一端，然后通过连接独特的 DNA 接头添加第二端即可实现。连接介导的 PCR 利用称为“接头 ”的小 DNA 片段，这些片段最初连接到目标 DNA 的片段上。然后使用旨在与接头序列结合的 PCR 引物来扩增靶片段。该方法用于 DNA 测序、基因组行走和 DNA 足迹。

19. 长范围 PCR（Long-Range PCR）长范围 PCR 是一种扩增通常无法使用常规 PCR 方法或试剂扩增的较长 DNA 的方法。通过使用具有增强 DNA 结合的修饰高效聚合酶，可以实现长片段的高效合成和准确扩增。这种方法允许在更短的时间内扩增更多扩展的靶标，并有效利用资源。

20. 甲基化特异性 PCR（Methylation-specific PCR，MSP）MSP 是一种检测和分析 CpG 岛中 DNA 甲基化模式的方法。为了进行 MSP，通过两个引物对修饰 DNA，并使用两个引物 对进行 PCR，这两个引物对分别是可检测的甲基化 DNA 和未甲基化 DNA。DNA 用亚硫酸氢盐处理以将胞嘧啶转化为尿嘧啶，然后用特异性引物选择性扩增甲基化序列甲基化模式的检测是必不可少的，因为启动子中 CpG 二核苷酸的过度甲基化会抑制基因表达。

21. 小引物 PCR（Miniprimer PCR）一种使用工程聚合酶和 10 个核苷酸“小引物 ”的新 PCR 方法。发现该方法揭示了标准引物无法检测到的新型 16SrRNA 基因序列。小引物 PCR 使用热稳定聚合酶，该酶可以从短引物（9 或 10 个核苷酸）延伸而来。该方法允许 PCR 靶向较小的引物结合区域，并用于扩增高度保守的 DNA 序列，例如 16S（或真核 18S）rRNA 基因。

22. 多重 PCR（Multiplex PCR）多重 PCR 是一种常见的分子生物学技术，用于在单次 PCR 检测运行中扩增多个靶标。在多重 PCR 中，多重引物和温度介导的 DNA 聚合酶用于 在热循环仪中扩增 DNA。必须优化为多重 PCR 设计的所有引物对，以便在 PCR 过程中所有引物对的相同退火温度都是最佳的。当一次靶向多个序列时，可以从单次测试运行中生成更多信息，否则将需要大量的试剂以及大量的时间和精力来执行。该技术已应用于基因分型、突变和多态性分析、微卫星 STR 分析、病原体或转基因生物检测等多个领域。在诊断实验室中，多重 PCR 可用于检测导致相同类型疾病的不同微生物。

23. 纳米粒子辅助 PCR （Nanoparticle-Assisted PCR，nanoPCR）纳米颗粒相关 PCR 包括小分子物质，这些物质由增强反应的特定物理性质组成。涉及金纳米颗粒的理论之一指出，这些颗粒吸附了一些聚合酶并管理系统中剩余的聚合酶量，这对于增强反应的

特异性可能是必要的。另一种理论解释说，它们吸附引物对并降低完美配对和错配对引物之间形成双链体时的熔解温度，这导致反应特异性的增加。纳米颗粒相关 PCR 具有高灵敏度、高特异性、高选择性等优点，已广泛应用于病毒检测和基因测序。

24. 巢式 PCR（Nested PCR）巢式 PCR 是对 PCR 技术的一种有用的修改，其中在两组引物的帮助下通过阻止非特异性结合来增强反应的特异性。第一组引物在我们的靶 DNA 外部 结合并扩增较大的片段，而另一组引物在靶位点特异性结合。在第二轮扩增中，第二组 引物仅扩增靶 DNA。巢式 PCR 是系统发育研究和检测不同病原体的有用方法。该技术具有更高的灵敏度；因此，即使样品中含有较低的 DNA，也可以被扩增，这在传统的 PCR 技术中是不可行的。

25. 重叠延伸 PCR （Overlap extension PCR，OE-PCR）这种方法也称为“通过重叠扩展进行拼接 ”或 SOEING。重叠延伸 PCR 是一种有价值的技术，通常用于克隆大型复杂片 段、对克隆基因进行编辑或将两个基因元件融合在一起。它从较短的 DNA 片段中产生长 DNA 片段。它用于高效的基因克隆和多位点定向大片段的插入、缺失和替换。它被证明可用于定点诱变、嵌合分子的产生，甚至通过将较小的片段剪接在一起来克隆大基因片段。

26. 定量 PCR/实时 PCR（Quantitative PCR/Real-Time PCR，qPCR）定量 PCR（ qPCR），也称为实时 PCR 或实时定量 PCR，是一种基于 PCR 的技术，它将目标 DNA 序列的扩增与反应中该 DNA 种类浓度的定量相结合。传统 PCR 是一个耗时的过程，其中 PCR 产物通过凝胶电泳进行分析。qPCR 通过在指数期提供产物的实时检测来促进分析 。实时荧光定量 PCR 的原理取决于荧光染料的使用。使用荧光染料或荧光标记的寡核苷酸对样品中存在的核酸浓度进行定量。qPCR 应用于病原体的基因分型和定量、microRNA 分析、癌症检测、微生物载量检测和转基因生物检测。

27. 基于重复序列的 PCR（Repetitive sequence-based PCR，rep-PCR）基于重复序列的 PCR（rep-PCR）是一种改进的 PCR 技术，它使用靶向散布在整个细菌基因组中的非编 码重复序列的引物。这种非编码、重复序列块可以作为寡核苷酸探针的多个遗传靶标，

从而能够为单个细菌菌株生成独特的 DNA 图谱或指纹图谱。rep-PCR 的主要应用是不同细菌的分子菌株分型。它还用于各种病原体的流行病学鉴别。

28. 逆转录 PCR（Reverse Transcriptase PCR，RT-PCR）逆转录 PCR（RT-PCR）是传统 PCR 的改进，其中 RNA 分子首先转化为互补 DNA（cDNA） 分子，然后可以通过 PCR 扩增。在 RT-PCR 中，首先使用逆转录酶将 RNA 模板转化为互补 DNA（cDNA）。然后，cDNA 充当

使用 PCR 进行指数扩增的模板。RT-PCR 可以在单管中进行，也可以在不同的试管中作为两个步骤进行。一步法更有效，污染和掺入变异的机会更少。RT-PCR 用于研究方法、基因插入、遗传病诊断和癌症检测。

29. 逆转录定量/实时 PCR（Reverse-Transcriptase Quantitative/Real-Time PCR ， RT-qPCR）RT-PCR 与 qPCR 的结合。这允许在扩增后实时定量 DNA。

30. 核糖核酸酶 H 依赖性 PCR（RNase H-dependent PCR）在 RNase H 依赖性 PCR 中，引物的 3'端包含一个可移除的扩增块。封闭的引物只能根据 RNase Henzyme 在与互补靶序列杂交过程中的切割活性进行扩增。RNase H 酶在低温下具有非常低的酶活性，无需对 DNA 聚合酶进行任何修饰即可实现热启动 。同样，当 RNA 残基附近存在错配时，酶的切割效率会降低。因此，在 RNase H 酶的活性下，非特异性结合和引物二聚体形成减少，从而实现有效杂交。

31. 单特异性引物 PCR（Single Specific Primer PCR，SSP-PCR）单特异性引物 PCR 是一种基于 PCR 的技术，允许扩增只有一段部分序列信息的基因。它允许基因组从已知区域单向行走到染色体的未知区域。这允许扩增双链 DNA，即使序列信息仅在一端可用。允许扩增只有部分序列信息可用的基因，并允许基因组从已知区域单向行走到染色体的未知区域。

32. 固相 PCR（Solid Phase PCR，SP-PCR）是一种独特的 PCR 技术，允许在固体支持 物上扩增靶核酸，其中一个或两个引物固定在表面。引物的空间分离最大限度地减少了显著不良的引物相互作用，从而防止了引物二聚体的形成，并允许更高的多重扩增。这种新方法的中心思想是将引物的 5 ′ 端附着在表面上，而不是让引物在散装溶液中自由扩散。可以在表面捕获自由扩散的 DNA 靶标，然后由聚合酶复制。拷贝保持附着在表面，而初始 DNA 分子在退火步骤后返回溶液。附着拷贝的自由端与与其序列互补的引物（附着在表面）杂交，扩增过程可以开始。

33. 自杀式 PCR（Suicide PCR）自杀式 PCR 是最常用的研究，其中避免假阳性和确保扩增片段的特异性是最高优先级。该方法只需要在 PCR 中使用一次任何引物组合，这不应该用于任何阳性对照 PCR 反应。这些引物应始终靶向在使用此特定引物或任何其他引物组之前从未扩增过的基因组区域。这种安排可确保实验室中不存在来自先前 PCR 反应的污染 DNA，否则可能会产生假阳性。自杀 PCR 用于古遗传学研究，其中涉及检查古代生物遗骸中保存的遗传物质。

34. 热不对称交错 PCR（Thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR）TAIL-PCR 是回收与已知序列相邻的 DNA 片段的强大工具。TAIL –PCR 在连续反应中使用三个嵌套引物和一个具有低熔解温度的任意简并引物，因此可以热控制特异性和非特异性产物的相对扩增频率。该方法高度准确，因此可以直接对未纯化的 TAIL-PCR 产物进行测序。它还允许克隆全长功能基因。

35. 降落 PCR（Touch down PCR）降落 PCR 是 PCR 的一种修饰，其中初始退火温度高于引物的最佳 Tm，并在随后的循环中逐渐降低，直到达到 Tm 温度或“ 降落温度 ”。降落 PCR 提高了较高温度下反应的特异性，并通过降低退火温度提高了接近尾声的效率。

36. 可变串联重复序列 PCR（Variable Number of Tandem Repeats PCR，VNTR-PCR）

它们是法医学个体化的重要标志。在 VNTR-PCR 中，扩增的片段在一个物种内几乎没有变化，但确实显示出物种之间的差异。它可以通过 PCR 从极少量的基因组脱氧核糖核酸（DNA）中成功扩增。在基因分型工具中，基于 VNTR-PCR 分析代表了一种很有前途的结核分型方法。

参考文献：

1. Paun, O., & Schönswetter, P. (2012). Amplified fragment length polymorphism: an invaluable fingerprinting technique for genomic, transcriptomic, and epigenetic studies. Methods in molecular biolog (Clifton, N.J.), 862, 75 – 87.

https://doi.org/10.1007/978-1-61779-609-8_7

2. Cardelli, Maurizio. (2011). Alu PCR. Methods in molecular biology

(Clifton, N.J.). 687. 221-9. 10.1007/978-1-60761-944-4_15.