实时荧光定量 PCR 技术：原理、操作与应用综述

在分子生物学领域，核酸检测技术一直扮演着至关重要的角色。其中，实时荧光定量 PCR 技术 以其高灵敏度、高特异性及快速检测的优势，成为了科研和临床诊断中的热门工具。本文旨在 详细介绍实时荧光定量 PCR 技术的原理、操作步骤及其在各领域的应用，为广大科研工作者和 临床医生提供有益的参考。

一、引言

实时荧光定量 PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称 qPCR）是一种在 DNA   扩增过程中实时检测和定量目标 DNA 的方法。 自问世以来，qPCR 技术在生命科学、医学、农  业等领域得到了广泛应用。本文将详细介绍 qPCR 的原理、步骤、荧光标记物、优势以及用途。

二、qPCR 原理

qPCR 的基本原理是利用荧光标记物对 DNA 扩增过程进行实时监测。在 PCR 反应体系中，加入 荧光标记的 DNA 双链特异性染料或荧光标记的特异性探针。随着 PCR 扩增的进行，荧光信号逐 渐增强，通过检测荧光信号的变化，可以实现对目标 DNA 的定量分析。

三、qPCR 步骤

1. 样本处理：提取待测样本中的总DNA 或 RNA，并将其转化为 cDNA。

2. PCR 反应体系配制：主要包括 DNA 模板、引物、dNTPs、DNA 聚合酶、缓冲液以及荧光标记 物。

3. PCR 扩增：在 PCR 仪上进行扩增，通常包括以下三个阶段：

（1）变性：将双链 DNA 解链为单链 DNA；

（2）退火：引物与目标 DNA 序列特异性结合；

（3）延伸：DNA 聚合酶在引物引导下，沿目标 DNA 序列延伸，生成新的 DNA 链。

4. 数据分析：通过荧光信号的变化，计算目标 DNA 的起始浓度。

四、荧光标记物

1. 双链特异性染料：如 SYBR Green I、EvaGreen 等。这些染料能特异性结合双链 DNA，随着 PCR 扩增的进行，荧光信号逐渐增强。

2. 特异性探针：如 TaqMan 探针、分子信标等。这些探针含有荧光基团和淬灭基团，当探针与 目标 DNA 特异性结合时，荧光基团和淬灭基团分离，荧光信号增强。

五、qPCR 优势

1. 高灵敏度：可检测到极低浓度的目标 DNA。

2. 高特异性：通过引物和探针的设计，可实现目标 DNA 的特异性扩增。

3. 实时监测：在 PCR 扩增过程中实时检测荧光信号，无需开盖，降低污染风险。

4. 精确定量：通过标准曲线法或比较法，实现对目标 DNA 的精确定量。

六、qPCR 用途

1. 基因表达分析：研究基因在不同样本、不同时间点的表达差异。

2. 病原体检测：如病毒、细菌、真菌等病原体的快速检测。

3. 基因突变分析：检测基因突变，如单核苷酸多态性（SNP）。

4. 基因拷贝数变异分析：检测染色体异常、基因扩增等。

5. 转基因成分检测：检测食品、农产品中的转基因成分。

总之，实时荧光定量 PCR（qPCR）技术凭借其高灵敏度、高特异性、实时监测和精确定量等优 点，在生命科学、医学、农业等领域发挥着重要作用。随着研究的深入，qPCR 技术将不断完 善，为科学研究和社会发展作出更大贡献。

转自：禾沐洋羊，